芽孢杆菌抗菌脂肽及其生物合成调控

第1章绪论001
1.1芽孢杆菌抗菌脂肽研究进展002
1.1.1脂肽的种类、结构与合成002
1.1.2抗菌肽合成的代谢调节007
1.1.3脂肽的功能及应用011
1.2基因组改组研究进展013
1.2.1基因组改组的原理013
1.2.2基因组改组的技术路线014
1.2.3基因组改组的应用016
1.2.4基因改组技术展望019
1.3蛋白质组学研究技术019
1.3.1蛋白质组学的分类020
1.3.2蛋白质组学的应用021
1.3.3蛋白质组学的研究策略022
1.3.4蛋白质组学技术面临的问题024
1.4本研究的主要工作024
1.4.1研究目的和意义024
1.4.2研究的主要内容025

第2章淀粉液化芽孢杆菌理化诱变选育surfactin高产菌株026
2.1材料027
2.1.1仪器设备027
2.1.2菌种028
2.1.3培养基与溶液028
2.2理化诱变与筛选方法029
2.2.1诱变方法029
2.2.2筛选方法031
2.2.3高效液相色谱（HPLC）测定脂肽含量032
2.2.4抗菌脂肽产量计算方法032
2.3选育结果与分析032
2.3.1紫外诱变032
2.3.2NTG诱变033
2.3.3离子束诱变035
2.4讨论036
2.5本章小结036

第3章基因组改组选育淀粉液化芽孢杆菌surfactin高产菌株038
3.1材料039
3.1.1仪器设备039
3.1.2菌种040
3.1.3培养基与溶液040
3.2基因组改组实验方法040
3.2.1菌种保存040
3.2.2菌种初级诱变041
3.2.3原生质体的制备、灭活、再生与融合041
3.2.4基因组改组042
3.2.5surfactin产量测定043
3.3结果与分析043
3.3.1初始菌株的筛选043
3.3.2原生质体的制备条件研究043
3.3.3原生质体灭活条件研究047
3.3.4融合条件研究048
3.3.5融合子的挑选050
3.3.6基因组改组050
3.3.7菌株摇瓶发酵比较051
3.3.8FMB38的遗传稳定性052
3.3.9原始菌株（ES-2-4）与改组菌株（FMB38）在发酵罐中发酵性能比较053
3.4讨论054
3.5本章小结056

第4章实时荧光定量PCR检测突变菌株FMB38脂肽合成酶基因表达057
4.1材料058
4.1.1试剂058
4.1.2菌种058
4.1.3仪器设备059
4.2突变检测方法059
4.2.1引物设计059
4.2.2RNA提取前的实验准备059
4.2.3RNA提取060
4.2.4RNA质量检测鉴定060
4.2.5反转录PCR061
4.2.6荧光定量PCR061
4.2.7样本表达量的标准化062
4.3结果与分析062
4.3.1RNA提取062
4.3.2目的基因与内参基因qRTPCR扩增063
4.3.3样本中靶基因的相对定量063
4.4讨论065
4.5本章小结066

第5章抗菌脂肽高产突变菌株FMB38差异蛋白质组学研究067
5.1材料068
5.1.1试剂及溶液068
5.1.2菌种069
5.1.3仪器设备070
5.2差异蛋白质组学研究070
5.2.1样品收集070
5.2.2全蛋白提取和定量070
5.2.3双向电泳071
5.2.4凝胶染色072
5.2.5图像采集及图谱分析073
5.2.6胶内酶解、质谱鉴定074
5.2.7数据库查询075
5.2.8生物信息学分析075
5.3结果与分析075
5.3.1双向电泳体系的建立075
5.3.2差异表达蛋白质的鉴定080
5.3.3蛋白质等电点和分子量分析085
5.3.4蛋白质的细胞定位分析086
5.3.5实验鉴定差异蛋白质分类与功能分析086
5.3.6几个差异蛋白点的肽质量指纹图谱分析091
5.4讨论098
5.4.1质谱分析098
5.4.2蛋白质翻译后修饰099
5.4.3与surfactin合成有关的蛋白099
5.4.4与代谢有关的蛋白质100
5.4.5能量产生与转化相关蛋白102
5.4.6DNA复制、重组和修复相关蛋白102
5.4.7翻译及翻译后修饰相关蛋白103
5.4.8与信号传导机制等有关的蛋白104
5.4.9假想蛋白与未知蛋白104
5.5本章小结105

第6章抗菌脂肽fengycin生物合成调控机理研究106
6.1材料107
6.1.1菌种107
6.1.2培养基与试剂107
6.1.3仪器设备108
6.2fengycin生物合成调控研究109
6.2.1筛选方法109
6.2.2高效液相色谱检测脂肽含量110
6.2.3抗菌脂肽产量计算方法110
6.2.4原始菌株的初级诱变111
6.2.5基因组改组112
6.2.6遗传稳定性试验112
6.2.7荧光定量PCR检测fengycin合成酶基因113
6.2.8蛋白质组学113
6.3结果与分析113
6.3.1初始菌株的筛选113
6.3.2基因组改组115
6.3.3FMB72遗传稳定性116
6.3.4fengycin产生菌生物学特性及发酵条件研究117
6.3.5靶基因fenA的相对定量118
6.3.6差异蛋白质组学相关研究119
6.3.7fengycin合成调控因子相关研究125
6.4讨论125
6.5本章小结127

第7章总结与展望129
7.1surfactin研究130
7.2fengycin研究130
7.3未来研究展望131

参考文献133